摘要：目的 优选酸枣仁中3种抗抑郁有效组分的最佳配伍比例。方法 根据均匀设计法进行分组，采用小鼠强迫游泳实验和悬尾实验，用小鼠不动时间作为药效学评价指标。结果 酸枣仁抗抑郁有效组分的最优配伍为总脂肪油10mg/Kg，总黄酮100mg/Kg，总皂苷10mg/Kg。验证实验证明，酸枣仁抗抑郁有效组分的最佳配伍组合抗抑郁疗效确切。结论 应用均匀设计法与药效学相结合确定酸枣仁活性组分配伍的方法是可行的。
关键词：酸枣仁；抗抑郁；均匀设计
Abstract：Objective To screen out the optimized compatibility proportion of three active ingredients of semen ziziphi spinosae foranti-depression.Methods Groups were arranged following uniform design.The forced swimming test，tail suspension test were carried out to determine theanti-depressantactivity in mice.Mice immobility duration in forced swimming test and tail suspension test were observed.Results The optimized dosage of total fatty oil was 10mg/kg，total flavonoids was 100mg/kg and total saponins was 10mg/kg.Conclusion It would be possible to use uniform design combined with pharmacodynamics method in defining the optimized compatibility of active ingredients of semen ziziphi spinosae.
Key words：Semen ziziphi spinosae；Anti-depression；Uniform design
酸枣仁（Zizyphi Spinosi Semen）为鼠李科Rhamnaceae植物酸枣（Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chow）的干燥成熟种子，具有补肝、敛汗、宁心、生津之功效，主要用于治疗虚烦不眠、体虚多汗、惊悸多梦和津伤口渴，《本草纲目》将其列为上品。
对酸枣仁的化学成分已有20多年的研究历史，近年有了较大的突破。酸枣仁富含脂肪油，其中含8种脂肪酸，大部分为不饱和脂肪酸，其它成分有白桦脂酸、白桦脂醇、当药素、酸枣仁皂苷及阿魏酸、维生素C等，且含多种氨基酸及微量元素[1]。其药用的物质基础较受关注的是酸枣仁皂苷A、B、Bl、黄酮苷、酸枣多糖等物质。普遍认为皂苷是酸枣仁的有效镇静成分，为三萜类化合物，在结构上与人参、三七等的皂苷类有效成分较为接近。酸枣仁皂苷A的含量明显大于酸枣仁皂苷B的含量[2]，对不同产地的酸枣仁的种皮、胚乳和子叶中酸枣仁皂苷A和B的含量进行测定，结果表明皂苷A和B主要存在于子叶中。刘沁舡等人以多种色谱方法分离化学成分，鉴定出新化台物酸枣仁皂苷D[3]。从酸枣仁的乙醇提取物中，用氢氧化钾和正丁醇处理，分得总皂苷、总黄酮、总酚性成分三部分。对总黄酮进行聚酰胺柱层析，从25%乙醇洗脱液中分得两种黄酮苷，经化学法和光谱法鉴定为Spinosin和Zivulgarin[4]。尹升镇等人[5]从酸枣仁中提取分离得到2种生物碱，经理化及UV，IR，1HNMR和MS波谱分析鉴定为Lysicamin和Juzirine，均为首次从该属植物中获得。就传统上不同炮制方法对药效影响的记载，李正娟等人进行全成分分析发现，生、炒酸枣仁化学成分差别不大[6]。酸枣仁的药理作用主要有镇静、催眠、镇痛、降温、降血压、降血脂、抗惊厥、抗抑郁、抗缺氧、抗肿瘤、抑制血小板凝集、增强免疫功能以及对心脏的保护作用等。随着分离技术的不断提高，对酸枣仁化学成分的研究也在不断深入，更多的药用成分不断被发现。对酸枣仁成分进行药理活性研究，可以阐明酸枣仁的药理作用和物质基础，以便更好地利用和开发。
前期研究表明，酸枣仁中抗抑郁作用有效组分为总脂肪油[7]、总黄酮[8]、总皂苷[9]。基于中药复方协同作用，本实验采用均匀设计法对酸枣仁中3种抗抑郁作用的主要成分进行配伍研究，筛选出酸枣仁抗抑郁组分的最佳配伍比例。
1 实验材料
1.1 实验动物 雄性ICR小鼠，SPF级，体质量（20±2）g，购于天津市山川红实验动物科技有限公司，合格证号：SCXK（津）2009-0001。在饲养环境下适应1w后使用，室温（22±2）℃，相对湿度65%～70%，光照12h，自由摄食、饮水。
1.2 药品与试剂 炒酸枣仁（购自天津中新药业集团有限公司，经天津中医药大学中药学院中药鉴定教研室张丽娟教授鉴定）自行提取，分离得到总脂肪油、总黄酮、总皂苷。
盐酸氯米帕明片，北京诺华制药有限公司产品，批号x0026，规格25mg/片，用前用2%吐温-80水溶液配制成1mg/mL盐酸氯米帕明溶液。
5 讨论
前期的研究结果表明，酸枣仁中的总脂肪油、总黄酮、总皂苷均具有明显的抗抑郁活性，因此采用均匀设计方法对酸枣仁中3种主要有效组分最佳配伍进行研究。相比传统的正交设计法，均匀设计在要考察的因素水平较多时，可减少实验次数，只需要与因素水平数相等次数的实验即可达到正交设计的实验效果[12-14]。
均匀设计的数学原理是数论中的一致分布理论，此方法借鉴了"近似分析中的数论方法"这一领域的研究成果，将数论和多元统计相结合，是属于"伪蒙特卡罗方法"的范畴。均匀设计只考虑试验点在试验范围内均匀散布，挑选试验代表点的出发点是均匀分散，而不考虑整齐可比。它可保证试验点具有均匀分布的统计特性，可使每个因素的每个水平做且仅做一次试验，任两个因素的试验点点在平面的格子点上，每行每列有且仅有一个试验点。它着重在试验范围内考虑试验点均匀散布以求通过最少的试验来获得最多的信息，因而其试验次数比正交设计明显减少，使均匀设计特别适合于多因素多水平的试验和系统模型完全未知的情况。例如，当试验中有m个因素，每个因素有n个水平时，如果进行全面试验，共有nm种组合，正交设计是从这些组合中挑选出n2个试验，而均匀设计是利用数论中的一致分布理论选取n个点试验，而且应用数论方法使试验点在积分范围内散布得十分均匀，并使分布点离被积函数的各种值充分接近，因此便于计算机统计建模。
均匀设计法的优点：布点均匀，代表性好；试验次数明显比其他方法少；可通过计算机给出的定量的数学模型进行处理，分析工艺条件结果的影响；试验的效益高。
均匀设计是通过一套精心设计的表来进行试验设计的，对于每一个均匀设计表都有一个使用表，可指导如何从均匀设计表中选用适当的列来安排试验。均匀设计分会还编制了一套软件《均匀设计与统计调优软件包》供试验设计和数据处理、分析使用，非常方便。均匀设计法的试验数据分析要用到回归分析方法，例如线性回归模型、二次回归模型、非线性回归模型以及各种选择回归变点的方法，也有利用多元样条函数技术、小波理论、人工神经网络模型应用于试验设计和数据分析，具体选择何种模型要根据实际试验的具体性质来确定。利用回归分析得出的模型，即可进行影响因素的重要性分析及新条件试验的结果估算、预报和最优化。
整个试验设计过程一般需要2～3轮次试验。通常首轮试验先在较大的条件范围内进行，初步建立起描述指标和因素见关系的数学模型，计算出模型在一定试验范围（原有试验范围或较原有试验范围适当扩大的试验范围）内可预报的最优值和试验条件组合，然后进行验证试验（多是因为最优条件在试验的边界或进行了模型的外推计算--在超出原有试验条件范围的情况下进行最优指标值和条件的预测计算）以检验和修正模型，之后缩小试验范围进行下一轮的更为精密的试验并进一步修正回归模型。一般通过这样的2～3轮试验即可达到试验目的，不但找到了最优的试验条件组合而且还建立了可定量描述指标和因素间关系的数学模型。依试验的目的和支持条件的不同，也可以利用均匀设计的试验点布点均匀、代表性强的特性，用直接观察法从所有试验中挑选表现最好的试验条件组合而结束试验设计（不再进行数据的分析处理），或挑选出最好条件后在该条件附近缩小试验范围进行更精密些的试验，直到实现试验目的而结束试验。使用均匀设计法进行试验设计，应尽量采用建模和进行试验优化分析的方式，透过模型可以对试验规律有进一步的提高认识，而不应该停留在简单的指标数值筛选上。
均匀设计法的注意事项：当所研究的因素和水平数目较多时，均匀设计试验法比其它试验设计方法所需的试验次数更少。但不可过分追求少的试验次数，除非有很好的前期工作基础和丰富的经验，否则不要企图通过做很少的试验就可达到试验目的。因为试验结果的处理一般需要采用回归分析方法完成，过少的试验次数很可能导致无法建立有效的模型，也就不能对问题进行深入的分析和研究，最终使试验和研究停留在表面化的水平上（无法建立有效的模型，只能采用直接观察法选择最佳结果）。一般情况下，建议试验的次数取因素数的3～5倍为好。
优先选用Un*表进行试验设计。通常情况下Un*表的均匀性要好于Un表，其试验点布点均匀，代表性强，更容易揭示出试验的规律。而且在各因素水平序号和实际水平值顺序一致的情况下，还可避免因各因素最大水平值相遇所带来的试验过于剧烈或过于缓慢而无法控制的问题。
对于所确定的优化试验条件的评价，一方面要看此条件下指标结果的好坏，另一方面要考虑试验条件是否合理可行的问题。要权衡利弊，力求达到用最小的付出获取最大收益的效果。
本研究所用酸枣仁总脂肪油、总皂苷、总黄酮的提取方法是根据此3种有效成分的极性等差异建立的一种系统提取分离法，分别利用石油醚提取法、大孔吸附树脂分离纯化各成分。
本实验所优选的是抗抑郁作用组分的配伍关系。通过小鼠强迫游泳实验及小鼠悬尾实验，考察小鼠强迫游泳实验及小鼠悬尾实验的不动时间，作为评价抗抑郁作用的药效学指标，将药效学与均匀设计法相结合，应用到中药有效组分配伍筛选工作中。运用相关软件分析，得出回归方程，可观察到各组分对作用效果的贡献大小及优化用量的信息。
6 结论
酸枣仁总脂肪油、总皂苷、总黄酮是酸枣仁发挥抗抑郁药效的有效组分，不同有效组分配伍均有不同程度的抗抑郁效果；最优配伍为总脂肪油10mg/Kg+总黄酮100 mg/Kg+总皂苷10 mg/Kg，其药效优于药材组；以均匀设计与药效学相结合确定中药有效组分配伍的方法是可行的。
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